website ? http://www.arda.or.th
Facebook ?https://www.facebook.com/ardathai
Line ✅https://line.me/R/ti/p/%40yhv6070r
ARDA ? https://www.facebook.com/kasetkaoklaiARDA2017
การพัฒนำชุดตรวจด้วยดีเอ็นเอเซ็นเซอร์สำหรับโรคพีอาร์อาร์เอสและโรคเซอร์โคไวรัสในสุกร
อุตสาหกรรมการเลี้ยงสุกรของประเทศไทยและของโลก พบกับปัญหาของการเกิดโรคระบาดที่เกิด จากการติดไวรัสภายในฟาร์มได้บ่อย และก่อให้เกิดความเสียหายและความสูญเสียอย่างมาก ได้แก่ โรคเซอร์โคไวรัส หรือ Porcine circovirus 2 (PCV2) ที่เป็นสาเหตุของกลุ่มอาการ post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) และกลุ่มอาการ PCV2-associated diseases (PCV2-AD) และโรคพีอาร์อาร์เอส (Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS) ซึ่งเป็นโรคที่เกิดจากการติดเชื้อไวรัสทางระบบสืบพันธุ์และระบบทางเดินหายใจในสุกร บ่อยครั้งที่พบการติดเชื้อร่วมกันของเชื้อไวรัสทั้งสองชนิดนี้พร้อมกันภายในฟาร์ม และหรือบางครั้งอาจพบการติดเชื้อไวรัส PRRSV มากกว่าหนึ่งสายพันธุ์ ซึ่งการติดเชื้อในลักษณะนี้ ทำให้เกิดปัญหาอย่างมากในการควบคุมป้องกันและรักษาโรค
วัตถุประสงค์ของการศึกษานี้
1. เพื่อพัฒนาชุดตรวจดีเอ็นเอเซ็นเซอร์ (DNA sensor) สำหรับการตรวจวินิจฉัยโรคติดเชื้อไวรัส PRRSV ร่วมกับโรคติดเชื้อไวรัส PCV2 ในสุกร พร้อมกัน ภายในการทดสอบครั้งเดียว
2. เพื่อพัฒนาชุดตรวจดีเอ็นเอเซ็นเซอร์ (DNA sensor) สำหรับการตรวจเชื้อไวรัส PRRSV ทั้ง 3 สายพันธุ์ ที่พบการระบาดในประเทศไทย ได้แก่ สายพันธุ์ยุโรป European strain: EU) สายพันธุ์อเมริกา (North America strain: US or NA) และสายพันธุ์ชนิดรุนแรง (Highly pathogenic strain: HP) ส าหรับการทดสอบครั้งเดียว ด้วยวิธีการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอที่อุณหภูมิระนาบเดียว (Loop mediated Isothermal
DNA amplification, LAMP) ร่วมกับการตรวจหาทางไบโอฟลูออเรสเซ้นต์ (Bio-fluorescent) ของโมเลกุลที่จับตัวกับดีเอ็นเอ (DNA) โดยทำการศึกษาเปรียบเทียบลำดับนิวคลิโอไทด์เบื้องต้นของเชื้อไวรัสทั้งสองชนิด เพื่อออกแบบและพัฒนาไพรเมอร์ (primer) ในการเพิ่มจำนวน DNA ของสารพันธุกรรมเป้าหมายทำการ
พัฒนารูปแบบปฏิกิริยาสังเคราะห์เพิ่มปริมาณ DNA ทำการออกแบบรูปแบบปฏิกิริยาที่สอดคล้องกับการเพิ่มปริมาณ DNA เป้าหมายจากตัวอย่าง โดยใช้ไพรเมอร์ที่จำเพาะ โดยมุ่งเน้นไปที่ยีนเป้าหมาย ในการแยกความแตกต่างระหว่างเชื้อไวรัส PCV2 และ PRRSV จะมุ่งเน้นไปที่ยีน ORF1 ในขณะที่การแยกความแตกต่างของเชื้อไวรัส PRRSV ทั้ง 3 สายพันธุ์นั้น จะมุ่งเน้นไปที่ยีนเป้าหมาย ORF7, ORF6/7 และ NSP2 ของสายพันธุ์ EU, US และ HP ตามลำดับ หลังจากนั้น ทำการทดสอบปฏิกิริยาในรูปและความไวของปฏิกิริยา ความเฉพาะเจาะจง ความสามารถในการทำซ้ำทำการพัฒนาระบบการตรวจวิเคราะห์ผลด้วยการตรวจสอบสัญญาณของสารพันธุกรรม จากการจับตัวระหว่าง DNA กับ binder ด้วยหลักการเรืองแสงฟลูออเรสเซนต์ด้วยโมเลกุลสี และใช้การเรืองแสงของหมู่เรืองแสงในรูปอนาล็อกดีเอ็นเอโพรบ (Analog DNA probe) ที่ติดหมู่เรืองแสงที่เป็นคู่สม การเรืองแสงของสัญญาณดีเอ็นเอจะเกิดขึ้นเมื่อโพรบจับกับดีเอ็นเอเ ป้าหมายบนพื้นฐานหลักการนิวคลิอิคไฮบริไดเซชัน (Nucleic hybridization) ทำให้เกิดการเรืองแสง และทำการทดสอบกับตัวอย่างที่ติดเชื้อไวรัส PCV2 และ PRRSV จากตัวอย่างเลือดหรือซีรัม และ/หรือตัวอย่างชิ้นเนื้อจากสุกรป่วยที่ได้รับการวินิจฉัยเบื้องต้นว่าติดเชื้อไวรัสทั้งสองชนิด
ผลการศึกษาพบว่าสามารถเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของไวรัสในระดับจำกัด (Limit of detection) ได้ที่ 100 ก็อปปี้ (copies) โดยมีความจำเพาะต่อไวรัสเป้าหมาย คือ เชื้อไวรัส PCV2 และ PRRSV และเชื้อ ไวรัส PRRSV ทั้ง 3 สายพันธุ์ และสามารถแยกความแตกต่างของการทดสอบจากไวรัสชนิดอื่น เช่น Porcine parvovirus, Classical swine fever virus และ Influenza A virus เป็นต้น ในการวิเคราะห์ผลด้วยการตรวจสอบสัญญาณ จากความจำเป็นที่ต้องทำการตรวจผลการเรืองแสงของเชื้อไวรัส PCV2 และ PRRSV ในปฏิกิริยาเดียวกัน และรวมถึงการตรวจผลการเรืองแสงของเชื้อไวรัส PRRSV ทั้ง 3 สายพันธุ์พร้อมกัน ทำให้ต้องใช้รูปแบบหรือ platform ที่เหมาะสมมารองรับในการทำงาน เพื่อที่จะตอบโจทย์การทดสอบแบบ monitoring assay ที่ทำได้ง่ายในภาคสนาม โดยไม่ต้องพึ่งพาห้องปฏิบัติการ หรือไม่ต้องการเครื่องมือขนาดใหญ่ หรือมีความซับซ้อนมากจนทำให้ขาดความคล่องตัว ดังนั้นในการศึกษาครั้งนี้ จึงเลือกใช้การพัฒนาห้องปฏิบัติการบนแผ่นชิปขนาดเล็ก (lab-on-a-chip) มาใช้งาน ผลการศึกษาพบว่าสามารถมองเห็นการเรืองแสงของหมู่เรืองแสงเกิดขึ้นด้วยตาเปล่าอย่างชัดเจน เมื่อโพรบทำการจับกับดีเอ็นเอเป้าหมาย สามารถตรวจวิเคราะห์การติดเชื้อไวรัส PCV2 และ PRRSV ทั้งสองชนิดได้อย่างมีประสิทธิภาพ โดยให้ความจำเพาะสูงถึง 90.9% ด้วยความไวของปฏิกิริยา 97.56% และให้ความสามารถในการทำซ้ าที่ 97.56% และเมื่อทำการตรวจในรูปปฏิกิริยาแยกหลอดบนแผ่นชิป สามารถตรวจวิเคราะห์การปนของเชื้อไวรัส PRRSV ทั้งสามสายพันธุ์ โดยให้ความจำเพาะสูงถึง 95.23% ด้วยความไวของปฏิกิริยา 98.76% และให้ความสามารถในการทำซ้ำที่ 99% ระยะเวลาที่ใช้ในการตรวจทั้งหมดประมาณ 1 ชั่วโมง แบ่งเป็นระยะเวลาที่ใช้ในการตรวจทั้งหมดประมาณ 1 ชั่วโมง แบ่งเป็นขั้นตอนในการสกัดสารพันธุกรรม 20 นาที การเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม 30-40 นาที และ การตรวจสอบสัญญาณการเปลี่ยนแปลงสี 1 นาที วิธีการทดสอบที่ได้มีประสิทธิภาพ ไม่ต้องพึ่งพาเครื่องมือที่ ซับซ้อน และสามารถตอบสนองหลักการ point of care
#สุกร
#ดีเอ็นเอเซ็นเซอร์
#ไวรัสพีอาร์อาร์เอส
#เซอร์โคไวรัส
#วิจัย
#สวก.