Development of multiplex PCR technique for detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC), Listeria monocytogenes and Salmonella spp. in foods
Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC), Listeria monocytogenes และ Salmonella spp. ยังคงเป็นปัญหาสําคัญทางสาธารณสุข โดยมีอุบัติการณ์ของโรคอาหารเป็นพิษจากแบคทีเรียกลุ่มดังกล่าวเกิดขึ้นอย่างต่อเนื่องทั่วโลก แนวทางการจัดการปัญหาดังกล่าวทางหนึ่ง คือการพัฒนาวิธีตรวจสอบแบคทีเรียชนิดก่อโรคแบบรวดเร็ว เพื่อช่วยทราบสาเหตุของการปนเปื้อนในอาหารได้อย่างรวดเร็ว ซึ่งจะทําให้การจัดการด้านความปลอดภัยอาหารเป็นไปอย่างมีประสิทธิภาพ เทคนิคมัลติเพล็กพีซีอาร์ เป็นวิธีการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมในหลอดทดลอง โดยใช้ไพรเมอร์หลายชนิด ที่มีความจําเพาะต่อการตรวจสอบยีนของแบคทีเรียกลุ่มเป้าหมายได้อย่างรวดเร็ว มีความจําเพาะ และมีความไวสูง
เทคนิควิธีการดังกล่าวนี้ พัฒนาขึ้นจากข้อจำกัดจากชุดตรวจสอบกับวิธีมาตรฐาน ปัจจุบัน พบว่าวิธีตรวจสอบของเชื้อเป้าหมายที่เราสนใจนั้น ส่วนใหญ่แล้วจะแยกกัน ในการตรวจสอบแต่ละเชื้อเป้าหมาย ส่วนวิธีมาตรฐานก็จะใช้เวลาค่อนข้างนานในการตรวจสอบเชื้อเป้าหมายแต่ละชนิด และมีขั้นตอนที่ซับซ้อนใช้เวลาประมาณ 3-5 วันเพื่อทราบผล
เนื่องจากจุดข้อบกพร่องตรงนี้ จึงพัฒนาวิธีการเพื่อตรวจสอบเชื้อเป้าหมาย 3 ตัวดังกล่าวได้พร้อมกัน จึงได้มาพิจารณาว่าวิธี multiplex PCR เป็นวิธีการหนึ่งที่เหมาะสมในการที่จะตรวจสอบเชื้อเป้าหมายทั้ง 3 ชนิดพร้อมกันได้ ก็คือเราต้องการตรวจวิเคราะห์เชื้อเป้าหมายทั้ง 3 ชิ้นก็คือ STEC, Listeria monocytogenes และ Salmonella ในตัวอย่างอาหารโดยที่เราให้ความสนใจไปที่เนื้อสัตว์สด เติมลงไปในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลว modified selective enrichment broth 225 ML แล้วก็นำไปตีป่น แล้วนำไปบ่มเพาะที่สภาวะที่เหมาะสม คือประมาณ 37 องศาเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ซึ่งก็จะพบว่าเชื้อเป้าหมายทั้ง 3 ชนิดที่โดยทั่วไปจะมีปริมาณปนเปื้อนในอาหารค่อนข้างต่ำเรา เมื่อบ่มในสภาวะดังกล่าวก็จะเพิ่มปริมาณมากขึ้นเพียงพอ ที่จะสกัดเอา DNA ของเขามาตรวจสอบโดยวิธี multiplex PCR ได้โดยใช้เครื่อง pcr หรือว่าพอลิเมอเรสเชนรีแอกชันก็คือพวกเทอร์โม Cycle ที่มีการควบคุมเรื่องของการขึ้นลงของอุณหภูมิและจำนวนรอบ เพื่อเลียนแบบการเพิ่มปริมาณของ DNA เป้าหมายจากสิ่งมีชีวิตนั้นโดยใช้ในรถของเป็นอุปกรณ์เครื่องมือที่มันสามารถควบคุมการขึ้นลงของอุณหภูมิได้ แล้วก็ผ่านขั้นตอนของ PCR เมื่อเพิ่มปริมาณเรียบร้อยแล้วเราก็สามารถที่จะเอามาร้านโดยการใช้เทคนิคเจลอิเล็กโทรโฟริซิสเพื่อวิเคราะห์ดูขนาดของ DNA เป้าหมายที่เกิดขึ้นภายใต้การใช้รังสี UV ก็จะเห็นแดนเป้าหมายของแบคทีเรียที่เราสนใจอยู่เกิดขึ้นถ้ามันมีการปนเปื้อนในตัวอย่างอาหาร
การพัฒนาเทคโนโลยี
การตรวจสอบแบคทีเรียกลุ่มเป้าหมายทั้ง 3 ชนิด ได้แก่ STEC, Listeria monocytogenes และ Salmonella ในตัวอย่างอาหารที่เป็นเนื้อสัตว์สด เติมลงไปในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลว ด้วยวิธีมัลติเพล็กซ์พีซีอาร์ที่ พัฒนาขึ้น มีความสะดวก รวดเร็ว และประหยัดค่าใช้จ่าย ทําได้โดยการใช้อาหารเลี้ยงเชื้อเหลว Simultaneous Enrichment Broth (SEB) เป็น enrichment ชนิดเดียว บ่มเพาะที่ 37 องศาเซลเซียส 24 ชั่วโมง สกัดดีเอ็นเอ ด้วยวิธีต้มร่วมกับเม็ดบีด แล้วทําปฏิกิริยามัลติเพล็กซ์พีซีอาร์ โดยใช้ไพรเมอร์จํานวน 5 คู่ที่ จําเพาะต่อยีนเป้าหมายของแบคทีเรียทั้ง 3 กลุ่ม ร่วมกับตัวควบคุมภายใน (Internal Amplification Control; IAC) ภายใต้สภาวะมัลติเพล็กซ์พีซีอาร์ที่ เหมาะสมแล้วตรวจสอบผลิตภัณฑ์ ด้วยวิธีอิเล็กโตรโฟรีซิส มีความไวในการตรวจสอบที่ 1 CFU/25 กรัม/ตัวอย่างอาหาร และสามารถตรวจสอบแบคทีเรียกลุ่มเป้าหมายทั้ง 3 ชนิด พร้อมกันในตัวอย่างอาหารสดได้ภายใน 26 ชั่วโมง
สามารถตรวจสอบแบคทีเรียก่อโรคกลุ่ม Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC), Listeria monocytogenes และ Salmonella spp. พร้อมกันได้ภายในครั้งเดียว
ใช้ตัวควบคุมภายใน (IAC) สําหรับปฏิกิริยาที่ช่วยป้องกันการเกิดผลลบปลอมได้ (falsenegative)
ใช้วิธีการสกัดดีเอ็นเอด้วยวิธีต้มร่วมกับเม็ดบีด ซึ่งประหยัด สะดวก และง่ายต่อการปฏิบัติ
ใช้อาหารเลี้ยงเชื้อเหลว SEB เพียงชนิดเดียว ในการเพาะเลี้ยงแบคทีเรียกลุ่มเป้าหมายทั้ง 3 กลุ่มในอาหารสด ซึ่งช่วยลดค่าใช้ จ่ายและประหยัด แรงงานในการตรวจสอบ เมื่อเปรียบเทียบกับวิธีมาตรฐานและชุดตรวจสอบแบบรวดเร็ว ทางการค้า
ผศ.ดร.สุดสาย ตรีวานิช ภาควิชาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีการอาหาร คณะอุตสาหกรรมเกษตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์
#มัลติเพล็กซ์พีซีอาร์ #ตรวจสอบแบคทีเรีย #STEC #งานวิจัย #สวก.
website ? http://www.arda.or.th
Facebook ?https://www.facebook.com/ardathai
Line ✅https://line.me/R/ti/p/%40yhv6070r
ARDA ? https://www.facebook.com/kasetkaoklaiARDA2017
เรื่องที่เกี่ยวข้อง
